背景
NF-κB是一种调节炎症和凋亡途径的转录因子。以往有研究显示，实验中缺氧缺血(HI)造模后0/3h腹腔注射NF-κB抑制剂TAT-NBD可显著减轻脑损伤；而在0/6/12h腹腔注射抑制剂反而加重了HI后的脑损伤。因此在本次实验中，作者进一步研究NF-κβ抑制剂给予的时间对HIBD的影响。
结果
01
HI诱导脑内NF-κB的动态变化
对新生儿缺氧缺血性脑损伤（HIBD）后脑组织NF-κB活性的动态分析表明，HI后0.5~6小时NF-κB活性明显升高，12h后恢复到基线水平。此外，在伤后24h观察到明显的NF-κB活化的第二个高峰。
HI后0/3h（0和3h）应用NF-κB抑制剂TAT-NBD可抑制HI后早期（0.5~6h）的NF-κB活性，而对HI后24小时NF-κB活性的第二个高峰无影响。为了抑制NF-κB早晚两个活性高峰，作者在HI后0、6、12h(0/6/12h)三个时间点给大鼠腹腔注射TAT-NBD。为了仅抑制NF-κB活性的第二个晚期峰值，TAT-NBD在HI后18和21h(18/21h)给予。结果实现，这种给药方式成功达成预期目的。
对NF-κB活性的抑制是NBD序列所特有的，作者用突变体——TAT-NBDmut给药对NF-κB活性并无影响。
图1：HI后NF-κB活性的动态变化
A：用32P标记的NF-κB探针进行EMSA分析，检测HI后不同时间点核提取液中NF-κB的活性。B：HI后24h，同侧半球NF-κB活性在0/6/12h或18/21h的TAT-NBD后受到抑制，而在0/3h的TAT-NBD后不受影响。各实验组对侧大脑半球NF-κB活性差异无统计学意义。
02
抑制NF-κB活性的时机对HIBD的影响
不同于0/3h给予TAT-NBD抑制早期NF-κB活性对HI后脑损伤具有的显著改善效果，0/6/12小时TAT-NBD的延长的给药方式（长期抑制）反而加重了HI后的脑损伤。长期抑制NF-κB也无法同早期抑制一样，改善神经元细胞中微管相关蛋白2（MAP2）的丢失，晚期抑制NF-κB（18/21h的TAT-NBD）甚至显著加剧了MAP2丢失。另外，TAT-NBD在0/3/6/12h的治疗导致与0/6/12h治疗相同的MAP2丢失量，说明在HI后3h延长治疗而不是省略给药，是导致早期抑制的神经保护作用消失的原因。TAT-NBDmut无药效。综上，这些数据提示TAT-NBD肽的早期治疗对HI后大脑的保护作用需要晚期的NF-κB活性。
图2：长期或晚期抑制NF-κB对HIBD的影响
A：6周时，各组大脑同侧半球脑体积。B：HI后48h定量MAP2的表达。C：HI后48h各组的代表性MAP2丢失图。
03
细胞因子表达与小胶质细胞活化
长期抑制NF-κB活性对HI后24h促炎因子IL-1β、TNF-α以及抗炎因子IL-4、IL-10和IL-1RA的增加并无影响。相反，0/3h的早期TAT-NBD治疗的神经保护作用阻止了HI后24h细胞因子的上调，即使这个时间点NF-κB的活性仍然保持。
与细胞因子数据一致，HI后24h，CD68染色显示，长期抑制并未降低小胶质细胞的活性；而早期抑制则可以完全抑制小胶质细胞的活化。
图3：HI诱导促炎细胞因子和抗炎细胞因子的表达及小胶质细胞的激活
HI后24h，通过RT-qPCR测定各组大鼠同侧半球TNF-α（A）、IL-1β（B）、IL-4（C）、IL-10（D）和IL-1RA（E）的表达情况。（F）HI后24h同侧半球海马区小胶质细胞激活情况。
04
长期抑制活性对促凋亡和抗凋亡分子的影响
作者团队之前的研究显示，HI后24h，0/3h的TAT-NBD治疗后的神经保护作用与完全阻止HI引起的胞浆细胞色素C和活性caspase-3的增加有关。而本次研究中，经长期抑制或晚期抑制NF-κB活性的TAT-NBD处理后，HI后24h裂解的caspase-3和胞浆细胞色素C与安慰剂组无显著差异。
图4：长期抑制治疗对HI诱导的细胞凋亡的影响
HI后24h，同侧半球胞浆中裂解caspase-3（A）及细胞色素C（B）的表达情况。
数据显示，HI后，胞浆和核中促凋亡因子p53随着时间的增加而增加（图5AB）。此外，p53下游促凋亡靶点PUMA在损伤后6h开始升高，在HI后12和24h表达增强（图5C）。尽管HI后24h，0/3h和0/6/12h的TAT-NBD处理均阻止了HI诱导的胞浆p53的增加（图5D），但只有0/3h的早期短暂抑制NF-κB可完全阻止HI诱导的核内的p53的升高，而0/6/12h的长期抑制则使HI诱导的核p53的增加保持不变（图5E）。与核内p53的结果一致的是，HI后24h，0/3h的早期抑制降低了PUMA的表达，而长期抑制反而显著增加了PUMA的表达。
接下来，作者测试HI诱导后抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xl的表达。结果发现，线粒体Bcl-2和Bcl-xl的表达从损伤后12h开始显著下降（图5GH）。长期抑制进一步导致Bcl-2和Bcl-xl的表达下降，相反，0/3h的TAT-NBD处理反而显著增加了HI后24h的Bcl-2和Bcl-xl表达。TAT-NBDmut无药效。
图5：长期抑制NF-κB对抗凋亡和促凋亡标志物的影响
HI损伤后24h内胞浆（A）和核内（B）p53、以及PUMA（C）表达情况。在不同时间点抑制NF-κB对胞浆（D）和核内（E）p53、以及PUMA（F）表达情况的影响。HI后24h内同侧半球线粒体Bcl-2（G）和Bcl-xl（H）的表达变化。不同时间点抑制NF-κB对Bcl-2（I）和Bcl-xl（J）的表达的影响。
05
0/6/12h的TAT-NBD在体外对神经细胞死亡的影响
在作者团队以往的研究中发现，一定剂量范围的TAT-NBD处理6h可保护培养的神经细胞免受细胞*作用。在本次实验中，即以上述剂量为参考，分别加入10、50、μmol/L的TAT-NBD和TAT-NBDmut与神经细胞培养24h。将人神经细胞系SK-N-MC和SH-SY-5Y暴露于μmol/L过氧化氢(H2O2)作为氧化应激模型，或用nmol/L星形孢菌素作为诱导剂诱导细胞凋亡。原代培养的皮层神经细胞则暴露于谷氨酸(50和μmol/L)。结果发现，24h培养结束后，神经细胞应对H2O2、星形孢菌素和谷氨酸，存活率随着TAT-NBD剂量的增加而不断降低，呈现明显的剂量依赖性。在未加入H2O2和诱导剂的对照组，TAT-NBD和TAT-NBDmut对细胞存活率无影响。
图6：0/6/12h的TAT-NBD可剂量依赖性地增加体外培养的神经细胞死亡
人神经细胞系SK-N-MC（AB）和SH-SY-5Y（CD）暴露于μmol/LH2O2、nmol/L星形孢菌素和10、50、μmol/LTAT-NBD24h。原代培养的皮层神经细胞暴露于50或μmol/L谷氨酸和10、50或μmol/LTAT-NBD中24h(EF)。MTT检测细胞存活率。
总结
在本次实验中，作者利用7日龄SD大鼠HIBD模型揭示脑损伤后24h内，NF-κB的活化出现早期（0.5-6h）和晚期（24h）两次峰值。根据此情况，作者使用NF-κB抑制剂TAT-NBD，并设置前期抑制（0/3h）、后期抑制（18/21h）和长期抑制（0/6/12h）三组，分别观察它们对HI后表观脑损伤、相关细胞因子表达和小胶质细胞活化等的影响。最终结果显示，在HI后早期（0和3h）抑制NF-κB活性而保留HI后24h时NF-κB的活性可以最大效率的改善HIBD；相反地，若抑制了后期NF-κB的活性反而加剧了HIBD。动物实验证明，如果时机选择得当，TAT-NBD治疗可能是对抗新生儿HIBD的一种非常有效的策略。
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